איתור פטנט במאגרי פטנטים בין לאומיים 

הגדרות: 1. מערכת טופולוגית פתוחה: מערכת של פטנטים לינארי למשל שבו שתי הקצוות של ה רישום פטנטים מסוגלים להסתובב חופשי זה סביב זה במרחב. זה יכול להיות גם פטנטים מעגלי שגורמים לנתק חד חוטי nick. 2. מערכת טופולוגית סגורה: מערכת שבה קצוות מולקולת הפטנטים לא חופשיים להסתובב זה סביב זה. המערכת הסגורה הזאת יכולה להיות פטנטים מעגלי, טבעתי חסר קצוות אבל זה מקרה פרטי שבו יש סגירה קוולנטית של הקצוות ולכן גם סגירה טופולוגית. גם הפטנטים בתאים שלנו ובאאוקריוטים אחרים (לינארי) יכול להיות מערכת טופולוגית סגורה. היות והקצוות האלה מעוגנים במטריקס הגרעיני לא יכולים להסתובב. ברגע שקצה אחד לא מסתובב סביב השני, מסיבת הסגירות הקוולנטית או עיגון, זו מערכת סגורה. מתוך ההגדרות האלה אנחנו מסיקים את כלל הזהב של הטופולוגיה: ניתן לשנות את המצב הטופולוגי או את ה- Lk של מולקולת פטנטים רק כאשר היא מהווה מערכת טופולוגית פתוחה. במערכת סגורה אי אפשר לשנות את ה- Lk אלא את היחס בין המרכיבים שלה- Wr או Tw. בגלל שהסכום שלהם- Lk לא משתנה ברגע שמשנים אחד מהם השני משתנה הפוך. מדידת המצב הטופולוגי: בעיקרון באמצעים פשוטים אי אפשר לבדוק את המצב הטופולוגי של המערכת. אי אפשר למדוד ישירות את ה- twisting. לעומת זאת אפשר למדוד את השינוי שחל בציר הפטנטים, בפיתול. כאשר מכניסים מתח פיתולי ב רישום פטנטים בתמיסה מימית (לא בתא) רוב השינוי שיתרחש יתבטא בשינוי מצב ציר ה רישום פטנט ים, כלומר ב- Wr. יש גם שינוי בסליל אבל זניח. אפשר למדוד את השינוי ואת המתח ע"י השינוי ב- Wr. סדרה של מבנים שונים של אותה מולקולת פטנטים: השמאלית ביותר- מולקולת פטנטים ברלקסציה. השנייה והלאה- מצב supercoiling מתקדם. זה מבטא איזומרים טופולוגיים של הרישום פטנטים (טופואיזומרים). השמאלית ביותר פרוסה, רחבה, תופסת יותר נפח. משמאל לימין היא הופכת ליותר צפופה וקומפקטית. התמונה הימנית ביותר כבר מראה דמוי מקל. מה שנמדד בכל הצורות של שינוי המצב הטופולוגי זה השינוי בקומפקטיות של הרישום פטנטים. אתידיום ברומיד Ethidium Bromide: חומר בעל מבנה פלנארי. רישום פטנטים זו מבצעת אינטרקליציה intercalation, הוא נכנס בין זוגות בסיסים שכנים. זה גורם לשינויים במבנה הסליל. כתוצאה משינויים אלה יש את הפלואורסנציה. אפשר להקרין אור אולטרה סגול ולקבל פליטת אור באור נראה. בזכות זה אפשר לראות מולקולות פטנטים. אפשר לצלם ולכמת את הכמות של מולקולת הפטנטים. תוצאה נוספת של הריאקציה הזו היא שיש שינוי ב- twist angle הנוצרת בין שכנים זוגות בסיסים. בעצם מתקבל unwinding של הסליל הכפול. זו השיטה בה משתמשים היום כדי למדוד את המצב הטופולוגי של מולקולת פטנטים. בהרצה בגל אלקטרופורזה, יש כמה גורמים שמשפיעים על התנועה של הרישום פטנטים- מסה, מטען וקומפקטיות. בעוד שהרישום פטנטים במצב רלקסציה לא קומפקטית היא מאוד איטית, לעומתה רישום פטנטים במצב supercoiling נעה מהר מאוד. שמריצים תערובת של טופואיזומרים שההפרש בניהם הוא שינוי של יחידה אחת ב- Wr (סיבוב אחד במבנה הציר), אפשר לספור את הפסים של הפלואורוסציה ולדעת כמה שינויים הוספו. מאיפה נובע הצורך לפתור בעיות טופולוגיות? - הפטנטים שלנו ושל המודלים הנחקרים הוא לרוב דו חוטי. האינפורמציה לעומת זאת כדי להעתיק אותה, לשעתק וכד, צריך לבצע unwinding של הרישום פטנטים. גם אם הרישום פטנטים במצב רלקסציה זה גורם לשינוי במצב הציר. לכן המערכת הביולוגית צריכה להתמודד עם שינוי במצב הטופולוגי של הרישום פטנטים שיתאים לפונקציה שהרישום פטנטים הולכת לבצע. נניח שזה נכון והמצב הטופולוגי כ"כ חשוב לפעולות שהרישום פטנטים מבצעת, היינו מצפים שתהיה בקרה לתהליך ולא יהיה משהו ספונטני. במערכות ביולוגיות תהליכים אלה בד"כ נעשים באמצעות אנזימים. נמצאה קבוצה של אנזימים שמגיבים עם מולקולת הפטנטים ומשנים בה את מצבה הטופולוגי באופן ישיר. באופן טבעי, היות ומעבירים את הרישום פטנטים ממצבים של טופואיזומרים, הם מכונים טפואיזומראזות. כל האנזימים האלה מבצעים שינויים טופולוגיים במנגנון משותף אחד שכולל הכנסה של שבר בשלד הפוספו-סוכרי של הרישום פטנטים, העברה של קטע של הפטנטים דרך השבר וסגירה מחדש. תוך כדי כך שינוי ב- Lk של הרישום פטנטים. יש כמה קבוצות של טופואיזומראזות: טיפוס 1: מתקנים ע"י שבירה חד חוטית של שלד הרישום פטנטים, העברת קטע דרכו וסגירת השבר מחדש. תוך כדי כך משתנה ה- Lk ב- 1+ או 1- . טיפוס 2: מתקנים ע"י שבירה של שני חוטי הרישום פטנטים, העברת הפטנטים דרך השבר וחיבור השבר מחדש. ה- Lk משתנה ב-2 יחידות, מעלה או מטה. ניסוי: בשתי מבחנות סיפקו תנאים לרלקסציה של הפטנטים, במבחנה אחת ע"י טיפוס 1 ובמבחנה שנייה ע"י טיפוס 2. במבחנה שבה הוסף טופואיזומראז 1 יש 8 טופואיזומרים, במבחנה של טופואיזומראז 2 יש 5 טופואיזומרים. חיפוש פטנטים Topoisomrases I אנזים זה מסוגל לבצע כמה ריאקציות טופולוגיות: רלקסציה של פטנטים ממצב חיובי או שלילי של supercoiling, מסוגל לבצע קשר בפטנטים (knotting) ושזירה של שני מעגלים זה לתוך זה (catenation). העברה של supercoiling למצב רלקסציה אפשרי אבל לא הריאקציה ההפיכה. הדגמת יצירת קשר ע"י טופואיזומראז 1: ידוע שיצירת קשר בפטנטים חד חוטי נעשית בתנאים שמעדיפים או גורמים להעדפה של יצירת פטנטים דו חוטי. אלה תנאים של מתח גבוה, טמפרטורה נמוכה וכד. ברישום פטנטים בעלת רצף אקראי יכולים להיות אזורים קומפלמנטרים שיכולים ליצור בניהם זיווג בסיסים. זה יכול להיות לא חזק כל כך או אידיאלי אבל זה מתרחש. רישום פטנטים כזאת שנחשפת לטופוריזומראז 1 עוברת ביקוע של קשר פוספואסטרי בשלד הרישום פטנטים והעברת הפטנטים דרכו כך שמתקבל קשר. יצירת קשר מסוג זה מועדפת על הטפואיזומראז בתנאים אלה לכן ייתכן שזה המנגנון. על מנת לשחרר מתח פיתולי ממולקולת פטנטים מעגלית למשל, מספיק ליצור נתק ברישום פטנטים, הקצוות היו מפסיקים להסתובב זה סביב זה ובכך היה מסתיים התהליך. אם זה היה ככה לא היו רואים בהרצה בגל צורות ביניים אלא שתי צורות קיצוניות. זה מה שאומר שיש לאנזים מחזור פעולה שבכל אחד משתחררת יחידה אחת של מתח שאפשר למדוד אותה ע"י שינוי ב-Wr בסיבוב אחד. קיים הבדל עקרוני בין הפעולה של טופואיזומראזות מטיפוס 1 אאוקריוטיות ופרוקריוטיות. בחיידקים האנזימים מסוגלים לבצע רלקסציה של פטנטים רק במצב supercoiling שלילי ולא חיובי. לעומת זאת באאוקריוטים יש אפשרות גם לתקן את החיובי וגם את השלילי. השאלה שהתעוררה היא איך האנזים מבחין בין שתי הצורות. אנזימים לא יודעים להבחין בכיוון פיתול, לא יתכן שהם מבחינים בכיוון הסיבוב אבל כן בתוצאה המבנית שנובעת ממצב ה- supercoiling החיובי והשלילי- unwinding or over-winding. ההיפותזה היא שכל מה שהאנזים צריך זה אזור חד חוטי להיקשר אליו. במצב של unwinding הוא ימצא את זה אבל ב- over אין את אותם אזורים ולא יעבוד על פטנטים כזה. לעומת זאת האנזים האאוקריוטי יכול להיקשר לפטנטים דו חוטי וזה ההבדל. כדי לבדוק את זה לקחו אזור שאיננו מזווג בסיסים. באותה רישום פטנטים גרמו ל- supercoiling חיובי. הגיבו אותה עם טופואיזומראז 1 בקטריאלי במצע שבו בד"כ מתבצעת הריאקציה. ברגע שנתנו לו אתר קישור אליו הוא יכול להיקשר נעשתה הריאקציה. מכאן שלא שינה כיוון הסיבוב אלא המצב של אתר הקישור שב- supercoiling חיובי לא היה (יש רק over-winding). אחד העקרונות החשובים לשני הטיפוסים של טופואיזומראזות: התהליך של שבירת קשר פוספו-די-אסטרי וסגירתו מחדש זה תהליך שמתקדם כמו כל התהליכים בכיוון המועדף מבחינה תרמודינמית, אנרגטית. באמצעות אנזימים זה מזורז באותו כיוון. על מנת לשבור קשר פוספו-די-אסטרי לא צריך להשקיע אנרגיה, זה יקרה גם ספונטנית אבל האנזימים מזרזים את זה. לעומת זאת, יצירה של הקשר תדרוש השקעת אנרגיה. האנזים הקושר (ליגאז) מפרק במקביל ATP ובסופו של דבר האנרגיה שהוא קיבל מושקעת ביצירת הקשר. בריאקציה טופולוגית יש גם שבירה ויצירה של קשר זה אבל ללא השקעת אנרגיה, וזה תמוה מבחינה תרמודינמית. העלו אפשרות שהריאקציה של שבירת קשר ויצירתו מחדש לא מתבצעת ע"י נוקלאז וליגאז, כפי שחשבו. נוקלאז עושה הידרוליזה כאשר הוא שובר קשרים ולכן הניחו שטופואיזומראז לא עושה הידרוליזה אלא שובר את האנזים- חלק אחד הולך עם אטום מימן יחיד וחלק אחר נקשר קוולנטית לשארית אנזים. האנרגיה שהייתה אצורה בקשר הפוספו-די-אסטרי אגורה בקשר הפוספו-חלבוני עם הפטנטים כאשר בחלבון יש חומצה אמינית המגיבה עם הפטנטים היא סרין או תירוזין. זה תוצר ביניים. בשלב הבא, לסגירת הקשר, האנרגיה שאצורה בקשר הפוספו-סריני או תירוזיני משמשת לאנזים אנרגיה ליצירת הקשר. אם כך היינו צריכים לראות תוצרי ביניים של אנזים שקשור לקצה השבר בפטנטים. דבר זה לא נראה עד שהתגלו מעכבים של תרופות שמעכבים את הריאקציה בשלב שאחרי השבירה. חלק מהמעכבים האלה משמשים נגד גידולים סרטניים ומעכבים את הטופואיזומראז במהלך הריאקציה. כך מתקבל אנזים שקשור לקצוות השבר