סריקת פטנטים מקצועית וחיפושים מתקדמים

בשלב הזה משתתפים חמישה שחקנים- הראשון הוא הצורה הדו חוטית של הגנום הנגיפי RF שנמצא רק בתא בזמן שהנגיף מוכפל. השני הוא חלבון שמקודד ע"י הגן geneA בנגיף, gpA. השלישי הוא תוצר הגן rep protein והוא פטנט ים הליקאז בקטריאלי. הרביעי הוא SSB שמקודד ע"י החיידק, חלבון עם אפיניות מאוד חזקה ל פטנט ים חד חוטי. החמישי והאחרון הוא ה פטנטים פטנט הולואנזים 3, מורכב ממספר תת יחידות. נתחיל בצורה של ה פטנטים הדו חוטי RF עם supercoiling, אותו מזהה החלבון gpA, טופואיזומראז מטיפוס 1, מאוד ייחודי. הוא מכיר רצף נוקליאוטידים מסוים- origin נקשר אליו ומבקע קשר פוספודיאסטרי מסוים ברצף. הוא נקשר לאתר ה- origin של סרט ה+, מבצע בו ניק ונקשר קוולנטית לקצה 5. זה אופן הפעולה של כל הטופואיזומראזות. כעת יש פטנטים דו חוטי מעגלי עם נתק ובקצה ה-5 של הנתק קשור קוולנטית חלבון gpA. בשלב הזה in vitro מוספים שני חלבונים- הליקאז rep ו-SSB. כעת rep מזהה פטנטים דו חוטי ומבצע בו unwinding תוך כדי פירוק ATP. מלבד זה, ל- gpA יש זיקה ל- rep והוא מתקדם איתו, יש לו אינטראקציה עם ה- rep ולכן הוא כאילו רודף אחריו בתהליך, נמצא תמיד במזלג ההכפלה. במקום זנב נוצרת לולאה בגלל ש- gpA מתקדם אחרי ה- rep ומושך את החוט אליו הוא קשור. SSB נקשר לסרט ה(-) שנחשף ולא נפגע. כלומר יש סרט עם ניק, SSB קשור לאזורים חד חוטיים ומונע מהם לבצע מחדש קישור ליצירת פטנטים דו חוטי. מצד אחד יש חוט לינארי ומצד שני מעגלי. בסופו של דבר תהיה הפרדה של סרטי ה+ וה(-). סרט לינארי של ה+ קשור בקצה ל- gpA וסרט ה(-) מעגלי עם SSB. יש פטנטים דו חוטי מעגלי עם הנתק וקשור קוולטית בנתק ל-gpA. כשלמערכת הזאת יש את rep, SSB ופטנטים פטנט 3, הקצה 3 ההידרוקסילי חשוף. פטנטים פטנט תופש את הקצה הזה ומסנתז סרט משלים, את סרט ה+. Rep עובר ועושה unwinding אז מתקבלת מערכת של template-primer. יש בעצם מזלג הכפלה שמתקדם על template. התהליך הזה חוזר על עצמו, rep מבצע unwinding, gpA הולך אחריו נחשפת לולאה וכן הלאה. המערכת מתקדמת סביב המעגל עד שמגיעים לאתר ה-origin החדש שסונתז. gpA רואה את אתר ה-origin החדש אליו הוא יכול להיקשר ולבקע קשר בו. הוא עושה זאת כאשר המזלג מגיע אליו. הוא נקשר קוולנטית לקצה 5 ובאותו זמן הוא מחבר את הקצוות של הסרט שעליו הוא ישב. כלומר, הוא מבקע את ה-origin החדש ומחבר את שני קצוות המעגל כך שמתקבל gpA קשור ל-origin חדש ויחידת סרט + משתחררת. התהליך מתחיל מחדש. להוסיף שקף 70 מבנה אתר ה-origin: קיימים שלושה אלמנטים בליבת האתר- (1) ORE (origin recognition element) בערך 13 נוקלאוטידים, אליו נקשר gpA. (2) אזור עשיר AT ומשמש כאלמט DUE (חיפוש פטנטים unwinding element) רצף נוקליאוטידים בעל פרופיל התכה נמוך יותר, יעבור unwinding בתחילת ההכפלה. (3) אזור recognition עם רצף cleavage שבו יבוצע priming, יבוקע ע"י ה-gpA בין G ל-A תמיד. gpA בנוי בצורה מיוחדת, יש לו שני שיירים פעילים טירוזינים, היוצרים את הקשר הפוספו-טירוזיני עם הנתק. המרחק בין השניים מתאים למרחק בין שני הפוספאטים בסיבוב מחזורי. gpA מתקשר לאתר ה-origin, מתקיים ביקוע של הקשר הפוספו-סוכרי וקישור קוולנטי לקצה ה-5 עם הטירוזין הראשון. הטירוזין השני בינתיים פנוי. מתבצע סיבוב על גבי המעגל ושוב מגיעים לנקודת ההתחלה. טירוזין 1 בינתיים תפוש בקצה ה-5 של הסרט שנדחה, הזנב. טירוזין 2 חופשי והוא המכיר את ה-origin החדש ותוך כדי כך שהראשון עוסק בחיבור הקצוות של הנתק הראשון השני כבר יוצר את הנתק הבא והתהליך מתחיל מחדש כאשר הטירוזין הראשון הוא זה שחופשי והשני קשור. ע"י החילופיות הזאת יש את היכולת של gpA למחזוריות בתהליך.

שיטות נוספות

פרופ דודי אנגלברג Reverse transcription and RNA replication מסה"כ החומר היבש בתא הרוב הם הריבוזומים. בין 10% ל-20% מהאנרגיה של התא מושקעת בתרגום. בתא יש עשרות אלפי ריבוזומים. חיבור של קשר פפטידי אחד עולה מינימום ארבע מולקולות עתירות אנרגיה. מבחינה אנרגטית ומבחינת משקל העיקר הם תהליכי התרגום. שלב הבקרה העיקרי הוא דווקא שלב השעתוק, לא התרגום. כדי שרקמה מסוימת תבצע את תפקידה עם משפחה של חלבונים מסוימת ואלמנטים מסוימים הבקרה תהיה על השעתוק של החלבונים הרלוונטים, ואחרי זה תרגום כמעט אוטומטי. מי שקובע את התפתחות התא אפילו משלב העובר, הדיפרנציאציה הספציפית וההתמחות הספציפית נעשית בשלב השעתוק. בתנאים מסוימים גם צריך לשנות אלמנטים בתא והשינויים האלה נעשים ברמת השעתוק. השעתוק הוא אחד התהליכים היחידים ששונים באופן מהותי בין אאוקריוטים לפרוקריוטים. תהליכי השעתוק בעלי הרבה אלמנטים דומים אבל עדיין יש מרכיבים מרכזיים שונים לחלוטין וזה נובע מעובדת ארגון הפטנטים בפרוקריוטים לעומת האאוקריוטים. קודם כל משפיעה נוכחות הגרעין וגם האריזה בכרומטין ודחיסה בכרומוזומים. בפרוקריוטים הפטנטים זמין והשעתוק נמנע בעיקר בנוכחות חלבונים אחרים כמו פטנטים. רנ"א קיים בטבע כמעט רק מתהליכי שעתוק. יש דוגמאות מעטות שהן יוצאות דופן ואלה היצורים שהגנום שלהם בנוי מרנ"א, נגיפים של צמחים למשל שהחומר הגנטי שלהם הוא בצורת רנ"א. יש גם רטרו-וירוסים שתוקפים תאים והופכים את הגנום שלהם בתא המאחסן מרנ"א לפטנטים. יש להם שיטות אחרות לבטא את הגנים מהגנום. פרט ליוצאי הדופן האלה נמצא בכל היצורים בטבע את הצורות השונות של הרנ"א שנוצרות מפטנטים בתהליך שעתוק. תהליך האפליקציה- גם הרנ"א מסונתז על גבי על תבנית של פטנטים. שם התהליך הוא חיפוש פטנטים dependent RNA synthesis. אפשר לראות בזה רפליקציה של גדיל אחד. מבחינת המנגנון הכימי והאנזימטי זה בעצם מנגנון של רפליקציה. לכן כל הכללים היסודיים של האנזימטיקה של הרפליקציה ומנגנון הפעולה של פטנטים פטנט תקפים גם לרנ"א פטנט. יש כאלה שלא זהים אבל הרוב כן. יש כמה תכונות משותפות לכל פטנטות שמייצרות חומצות גרעין: (1) הריאקציה של הפולימריזציה של הפטנטים והרנ"א כיוונית מ-5 ל-3 ולכן התוצר לא סימטרי, יש שני קצוות שונים. (2) הנוקאוטידים תמיד מחוברים בקשרים פוספו-די-אסטרים על גבי תכונות יציבות שלהם. סינתזה של כל נוקליאוטיד נוסף דורשת ביקוע של קשר אנרגטי. במקרה של פטנטים פטנטות המונומרים הם ד-אוקסיריבוז ורנ"א אוקסיריבוז. (3) כל הריאקציות האלה של הפולימריזציה דורשות תבנית. כדי שתיווצר אינפורמציה נכונה צריך תוכנית. אין פטנט שיוסיף נוקליאוטידים באופן רנדומאלי. פולימריזציה של רנ"א אותה ריאקציה מבחינה אנרגטית. לאנזים הרלוונטי יש יכולת להוסיף נוקליאוטיד לשרשרת ומשתחרר פירו-פוספאט. ברמה האנזימטית הריאקציה זהה לפולימריזציה של פטנטים, כאמור גם בדמיון מלא או זהות לתהליכים אלה הריאקציה צריכה תבנית ולא תצא לפועל בלעדיה. ידוע הרבה יותר טוב את תהליך הריאקציה ומנגנון הפעולה שלה מאשר פטנטים פטנטות כי הצליחו לגבש את פתרון המבנה של רנ"א פטנט בשמרים, וחיידקים מסוימים על גביו. ידוע איך נראה האתר הפעיל ומה קורה בו. ההנחה היא שקורה בדיוק אותו דבר בפטנטים פטנטות. הריאקציה עצמה מתאפשרת בזכות התקפה נוקלאופילית של הידרוקסיל 3 של הנוקליאוטיד האחרון בשרשרת. הנוקליאוטיד הבא באתר הפעיל מיוצב באתר הפעיל ע"י זיווג בסיסים כדי שזה יהיה הזיווג הנכון ובדרך נוספת (בהמשך). ייצוב הנוקליאוטיד חשוב כי התקפה נוקלאופילית של הידרוקסיל לא תהיה מספיק חזקה בשביל לתקוף פוספאט אלפא, צריך אקטיבציה. צריך להוריד את אנרגיית האקטיבציה ולהביא את הנוקליאוטיד מול הסובסטרט השני שבתבנית. כיום תהליך זה ברור בגלל פתירת המבנה. באתר הפעיל של הפטנט שלושה שיירים של חומצה אספרטית קשורים ליוני מגנזיום, שנמצאים בכל הפטנטות, אחד נמצא באינטראקציה עם פוספאט אלפא, השני עם בטא ועם גמא, כך שהם מחלישים את הקשר בין שני הפוספאטים והם הרבה יותר זמינים לניתוק וסילוק שלהם והחלפת הקשר שלהם לפוספאט אלפא לקשר של ההידרוקסיל עם הפוספאט. זה מצב הביניים שממנו הריאקציה יכולה ללכת גם אחורה וגם קדימה אם אנרגיית האקטיבציה יותר נמוכה עקב הקשר של המגנזיומים לפוספאטים. הכל יותר נוח לפעולה בזכות מצב הביניים. ברגע שהקשר ייווצר, כל האנזים יזוז עמדה נוספת ויכנס נוקליאוטיד אחר לאתר הפעיל. ?התוספת של נוקליאוטיד מעורבת בהתקפה נוקלאופילית של ההידרוקסיל ה-3. יש שני יוני מגנזיום באתר הפעיל של רנ"א פטנט שקשורים לשלוש חומצות אספרטיות באתר הפעיל, יון מגנזיום אחד מאפשר ומחזק את האפשרות של ההתקפה הנוקלאופילית בגלל שהוא קשור לחמצנים של הפוספאט אלפא והשני קשור לבטא וגמא יותר חזק אז הוא מאפשר את הניתוק שלהם מאלפא. בכל פעילות אנזימטית ההגעה לשלב הביניים זה השלב הקשה, לעבור את אנרגיית האקטיבציה. תהליך הרפליקציה: אין פטנטים פטנט שיכול לעשות סינתזת דנובו בעצמו, הוא לא יחבר שני נוקליאוטידים לבד וייצור קשר פוספו-די-אסטרי. הוא צריך template ופריימר כדי לעשות את זה. תכונה נוספת שייחודית לו היא שיש לו בנוסף לפעילות 5 ל-3 פעילות אקסונוקלאז 3 ל-5, וזה חלק מהגהה של הריאקציה. האנזים עצמו יכול לזהות טעות ולתקן את עצמן. בנוסף הסובסטרטים חייבים להיות דה-אוקסי-פוספאטים. תכונה נוספת של תהליך הרפליקציה היא שהיא מתרחשת פעם אחת בחיי התא. הרפליקציה של הפטנטים מתחילה ממקור אחד, בעיקר בפרוקריוטים, ה-origin, ברגע שמגיע זמן בשלב s במקומות מסוימים של פרוקריוטים זה מתחיל ממקום אחד בגנום. ברגע שה-origin מזוהה מערכת ריאקציות של פתיחה וייצוב שלו מתרחשת ואז נפחות מזלגות הרפליקציה- הרפליקציה הולכת לשני הכיוונים. פעם אחת בחיי התא היא מתחילה במקום מסוים והולכת לשני הכיוונים. שני הגדילים משוכפלים. ה-leading בבת אחת וה-lagging במקטעי אוקזאקי, כך או כך שניהם מסונתזים. באוקזאקי צריך פריימר חדש בכל פעם, האזורים משוכפלים בחלקים וכל פעם הפריימר נופל. כל האזורים האלה מחוברים, אין ניקים. בסופו של דבר הם גם מסתיימים במקום מסוים לשכפל את הגדילים. זה אתר הטרמינציה. במשך כל התהליך יש הגהה ותיקון אם נכנס נוקליאוטיד לא נכון. בעזרת פטנטים פטנט יש הגהה מ-3 ל-5. כמו כן, גם כשהתהליך הסתיים ונוצרו שני dsחיפוש פטנטים, אם יש שגיאות עוד אפשר לתקן אותן בדקות שאחרי הרפליקציה. יש מנגנון שמזהה את השגיאות- post replication repair. תהליך השעתוק: כל הגנום משוכפל ברפליקציה. אסור שיהיה יותר מדי או פחות מדי חומר. ברגע שהפטנטים פטנט יוצא לשני הצדדים הוא משכפל את כל הגנום עד הסוף. לעומת זאת בשעתוק חלקים קטנים בגנום משועתקים בכל פעם. קשה יותר להבין את זה, מתחילים במקום מסוים וממשיכים לשעתק עד נקודה מסוימת. יש גם תזמון אחר, שכפול הוא פעם אחת בחיי התא וכל רישום פטנטים בסוף עוברת לתאי הבת. לגבי שעתוק חלק מהאזורים בגנום משועתקים חלק מהזמן. יש עשרות אלפי ריבוזומים בתאים והחלבונים של הריבוזומים צריכים להיות כל הזמן, החלקים המקודדים לריבוזום ישועתקו כל הזמן ללא הפסקה. בתוך הריבוזום מרכיב מבני של הריבוזום הוא רנ"א ריבוזומאלי. מסנגר מהווה פחות מאחוז או שניים של רנ"א בתא. הרנ"א הריבוזומאלי תמיד נמצא במבנה הריבוזום. יש גנים אחרים שמשועתקים רק חלק מהזמן, אם תאים צריכים לייצר חלבון או לתקן משהו בתא צריך שעתוק של רנ"א מסוים ואז להפסיק אותו. יש חלקים בגנום שבתנאים מסוימים אף פעם לא ישועתקו. יש אינסוף בקרות על כל הגנים