חיפוש פטנטים ורשימת עורכי פטנטים

 Topoisomrases II טופואיזומראז מטיפוס 2 מקטלזות את כל הריאקציות המשונות במנגנון שכולל שבירה של מולקולת פטנטים דו חוטית, העברה של חלק מהרישום פטנטים דרך השבר לסגירה מתואמת שלקצות מולקולת השבר מחדש. הם מסוגלים לבצע 6 ריאקציות טופולוגיות שונות: (1) רלקסציה של מולקולת פטנטים דו חוטית, הפיכתן למצב relaxed. (2) הריאקציה ההפוכה כמעט באותו מנגנון שבה הופכים רישום פטנטים ממצב רלקסציה ל- supercoiling כאן דרושה אנרגיה. (3) יצירת קשר דו חוטי knotting (4) התרת קשרים מפטנטים דו חוטי (5) שזירה של שני מעגלים זה בזה, או יותר מעגלים, בקישור טופולוגי catenation (6) Decatenation את צמד הריאקציות הראשון טופואיזומראז מטיפוס 2 של חיידקים הוא היחיד הידוע שיכול לעשות את זה, לא התגלה אנזים אאוקריוטי שיכול לבצע את זה. אנחנו מכירים בטבע מקרה שבו חושבים שיש הבנה בשביל מה צריך קשרים בפטנטים- קיים בקטריופאג שנקרא P4 שבמהלך ההבשלה שלו, כשהפטנטים נכנס למעטפת ויוצר נגיף בשל, הפטנטים צריך להידחס ואז מתחילים לראות קשרים בפטנטים. זה מתחיל מקשר אחד ועובר הלאה להרבה קשרים. תוך כדי יצירת הקשרים הפטנטים הולך ונדחס. המחשבה היא שזה המנגנון שהנגיף משתמש בו בשביל לדחוס את הפטנטים למעטפת הנגיף. אין לזה הוכחות עדיין. אפשר לראות מולקולות שמורכבות משישה קשרים, שישה מעברים בין פטנטים דו חוטי לפטנטים דו חוטי. הבעיה בצילום פטנטים היא הקוטר שלו, צריך לעבות אותו ע,י ציפוי בחלבון בסיסי בגלל שזה מתחת לרזולוציה. ברגע שהרישום פטנטים נהיית יותר עבה היא כבר לא תופסת את האלקטרונים, אז מצפים את זה במתכת. לכן בתמונות אנו רואים רישום פטנטים מעובה מצופה מתכת. הנקודה היא שיש תיאוריה שיצירה של קשר או קשרים בפטנטים יכולה להיות תוצר ביניים בתהליך רקומבינציה גנטית. העובדה שאנו יוצרים קשר וגורמים להצלבת קטעי פטנטים שבעצם רחוקים זה מזה מאפשרת לאנזימים לבקע את הקשרים הפוספו-די-אסטרים ולעשות קשרים עם

טבע ביולוגיה ופטנטים

 קטעים שונים ברישום פטנטים. צמד הריאקציות האחרון מוכר מדוגמא דרמטית בטבע- catenane בטבע שמורכב מהרבה מאוד מעגלים, הוא גדול מאוד והקשרים קשורים בקשר טופולוגי מאוד מיוחד! כל אחד מהמעגלים שזור לשלושה מעגלים נוספים יש מערכת שלמה ששומרת על הסדר. במקור הרשתות שהם הפטנטים המיטוכונדריאלי הם אלפי מעגלים קשורים זה לזה טופולוגית. אנחנו יכולים להבחין בצורות השונות לא רק במיקרוסקופיה אלקטרונית אלא גם בהרצה בגל. מה שמשפיע זה גם המסה אבל בעיקר המבנה, הקונפורמציה של הרישום פטנטים. ככל שהיא קומפקטית יותר היא תרוץ יותר מהר. הרישום פטנטים העליונה היא במצב רלקסציה ורצה הכי לאט למקום מסוים. הרישום פטנטים השנייה בעלת אותה מסה בדיוק אבל מורכבת משני מעגלים אבל יש לה יותר קומפקטיות. הרישום פטנטים שאחריה עם קשר נוסף והיא רצה מהר עוד יותר. אחריה יש supercoiling אז היא רצה מהר מאוד וכך האחרונה. כלומר, ככל שהרישום פטנטים קומפקטית יותר יש לה יכולת לרוץ יותר מהר בגל ואז אפשר להבחין בה. הריאקציה הראשונה של ה- supercoiling, שרק טופואיזומראז גיראז בקטריאלי עושה אותה. על מנת להסביר בפירוט את המנגנון נתייחס לאנזים חיפוש פטנטים Gyrase. במשך שנים רבות ידענו שיש שני גנים ב-e.coli שדרושים לרפליקציה של החיפוש פטנט ומוטציה בהם מביאה לעמידות לשתי תרופות שונות. הגן הראשון הוא Nal מוטציה בו מקנה עמידות לתרופה naladixic acid. הגן השני נקרא Cou והוא לאנטיביוטיקה coumarmycin A1. לימים התברר שהגנים מקודדים לפטנטים גיראז. הוא טטרמר- שתי יחידות a שהן תוצר של Nal, ושתי יחידות b שמקודדות ע"י Cou. על מנת לפעול על הפטנטים ולבצע בו שינויים טופולוגיים האנזים צריך להיות מסוגל לקשור פטנטים, צריכה להיות לו אפיניות או אתר קשירה. הוא צריך להיות מסוגל אחרי הקשירה לבצע חיתוך דו חוטי ברישום פטנטים ע"י שבירת שני קשרים פוספו-די-אסטרים. בריאקציה של גיראז לכיוון supercoiling צריך אנרגיה אז האנזים גם צריך להיות בעל אפיניות ל-ATP ולבצע הידרוליזה כדי להפוך אותו ל-ADP+P. התכונה הנוספת היא שהוא צריך להיות מסוגל להעביר קטע של שבר ולסגור מחדש את השבר. הריאקציה הראשונה- קישור של האנזים לפטנטים. שלוש נקודות חשובות: הרצף אליו הוא נקשר; האופן אליו נקשר; הכיווניות. פטנטים גיראז נקשר לפטנטים ברצף קונצנזוס. אין רצף אחיד אבל מוטיבים משותפים אליהם ייקשר האנזים. צורת הקישור היא ע"י כריכה של הפטנטים סביב מולקולת החלבון- סביב האנזים. על מנת שהפטנטים יוכל להיות כרוך סביב ציר (היות ויש שני רדיוסים שונים) הרישום פטנטים צריכה להתרחב בצד החיצוני ולהצטמצם בחלק הקרוב לחלבון. כלומר התכונה הדרושה לכך היא הגמישות. זאת אומרת בחלק החיצוני ה-major groove מתרחב יותר והוא נגיש יותר לאנזימים, בחלק הפנימי קורה ההיפך. אנחנו מסוגלים לזהות את זה ע"י טיפול בנוקלאז והרצה שלו בגל. בגל נראה אזורים רגישים לנוקלאז ואלה יהיו האזורים החיצוניים. בטיפול כזה אפשר לזהות דגם שכל 10 בסיסים בערך יש אזור היפר רגיש ואחריו אזור עמיד, וזה אומר שהרישום פטנטים נכרכת סביב חלבון. עניין הכיווניות חשוב מאוד הוא מאוד עקרוני במקרה של הגיראז. כל אנזים שמסובב ל- supercoiling דואג לא לסובב את הקצוות. שמשנים את כיוון ההעברה מבטלים את הפעולה שנעשתה- כלומר, כל עוד שמעבירים באותו כיוון את הקטע דרך השבר יוצרים סיבובים טופולוגיים אבל אם הופכים את הכיוון ומעבירים לצד ההפוך גורמים לרלקסציה. לכן הכיווניות של פטנטים גיראז מוכתבת ע"י העובדה שהוא כורך את הפטנטים בכיוון מסוים בכל מחזור פעולה. לכן אפשרית הצבירה של שינוי. אילו האנזים לא היה מקפיד על כריכה בכיווניות מסוימת היינו מקבלים יצירה של supercoiling ובהעברה הבאה הרישום פטנטים הייתה חוזרת לכיוון ההפוך כי הרישום פטנטים עצמה שואפת לחזור למצב אנרגטי נמוך יותר. בלי אילוץ הכיווניות לא היה נצבר שינוי. בשביל ליצור catenane זה ברור שצריך לשבור את אחד המעגלים, כך לגבי ריאקציה של שבר. זה לא ברור למה בשביל supercoiling צריך לעשות חיתוך. אתר החיתוך נמצא ברצף הקונצנזוס, והחיתוך מדורג- יש רצף של ארבעה זוגות בסיסים בין חיתוך בכל חוט. חיתוך דו חוטי ובהמשך סגירתם מחדש, מקוטלז ע"י תת היחידות a. הקישור של ATP ופירוקו מקוטליזם ע"י תת היחידות b לכן הקישור וההידרוליזה רגישים לתרופות coumarmicyn. הגיראז הוא מקבוצת האנזימים שיכולים לעשות קישור והידרוליזה רק כאשר הם קשורים לפטנטים. העברת הקטע דרך השבר- כאשר ה- Lk מוגדר בין שני מעגלים שנמצאים שזורים זה לזה במרחב. שיש שני מעגלים שחוצים זה את זה ה-Lk הוא 2. אפשר למדוד את השינוי הטופולוגי שחל. אם כן, אם רואים שינוי טופולוגי של 2 בטופואיזומראז 2 ושינוי 1 בטופואיזומראז 1 אז שינוי של 2 ירמז על שני חוטי פטנטים שחצו שני חוטי פטנטים. מצב של Lk ששווה 0 לא ממש קיים, רק במצבים מסוימים. אבל נאמר שיש רישום פטנטים כזו וטופואיזומראז מופעל עליה, הוא יחתוך חוט אחד ממנה ויעביר דרך החיתוך קטע מהרישום פטנטים. כעת Lk=1. הפעילות של טופואיזומראז 2 תתחיל מחיתוך של שני חוטים שדרכם יעבור מקטע אחר של הרישום פטנטים. כעת Lk=2. אם הקצוות היו מסתובבים °360 אז היינו מבטלים סיבוב אחד של החוטים. שני סיבובים מלאים של הקצוות יבטלו את השינוי בכלל, המצב יחזור ל- Lk=0. הכיווניות של הכריכה היא בעצם זו שקובעת את כיווניות ההעברה. ברגע שטופואיזומראז חותך את הגדילים הוא נקשר קוולנטית לקצוות ה-5 של השבר. הקשר הוא טירוזיני (טירוזין באנזים ופוספאט של הגדיל). אין קשר קוולנטי לקצה 3 אבל יודעים שיש אינטראקציות אלקטרוסטטיות חזקות. הקצוות 3 קשורות לתת היחידות a ששברו את החוטים. האנזים יושב בעצם באזור השבר ומקבע את הקצוות. במילים אחרות, הוא יצר מערכת טופולוגית סגורה. מנגנון הפעולה של הגיראז. האנזים נקשר לרצף הקונצנזוס, יוצר שבר מעביר בו קטע ומחבר. כמה מודלים: (1) מודל Double molecular gate- יש קישור כריכה של מולקולת הפטנטים סביב האנזים. העברה של קטע דרך השבר וסגירה. תת היחידות a על שטח הפנים קושרות את הפטנטים, יש שבירה של אתר החיתוך ובשלב הזה נקשר ATP ע"י תת היחידות b. כתוצאה מהקישור יש שינוי קונפורמציה באנזים. תת היחידות a מתרחקות אחת מהשנייה ומאפשרות להעביר קטע דרך השבר שעכשיו יושב בתוך מולקולת האנזים, היא מכילה את קטע הפטנטים. בשלב הזה מתפרק ה-ATP בהידרוליזה. ADP לא מסוגל לשמור את המצב החדש, את שינוי הקונפורמציה. גם האפיניות שלו לאנזים נמוכה. לכן הוא משתחרר והמצב חוזר לקדמותו, תת היחידות משתחררות והקטע של הפטנטים שהיה באנזים עובר. המנגנון הזה בעצם די רגיל בריאקציות ביולוגיות- קישור נוקלאוטיד והידרוליזה שמחזירה את המצב לקדמותו זה דבר מאוד מקובל, גם בשעתוק והכפלה. יש מה שמניע שינוי מבני ומספק אנרגיה. מסלולים מטבוליים שונים פיתחו את אותו מנגנון. זאת התנהלות של שינויים מבניים שמביאים לריאקציה. הדברים האלה מוכרים בזכות מקורות אנאלוגים לנוקלאוטידים. ATP הוא בעצם אדנוזין ושלושה פוספאטים. האנאלוגים האלה מאכלסים חמצן בין פוספאט בטא לגמא, והקשר הפוספו-די-אסטרי הזה הוא שמבוקע בהידרוליזה. אפשר להחליף את החמצן בחנקן או פחמן. האנאלוג AMP-P-O-P: אפשר לרמות את רוב האנזימים לצורך קישור. הגיראז לא יכול לבקר את הקשר בין הפוספאטים אבל כן לקשור אותו. כלומר בגלל שהוא מסוגל לקשור ולא לבצע הידרוליזה אפשר להפריד בין שני התפקידים האלה של ה-ATP. מכאן אנחנו יודעים שהקישור שלו גורם לשינוי עבר למטה